بررسی حضور اشرشیاکلی شیگاتوکسیژنیک و انتروپاتوژنیک در گوساله های مبتلا به اسهال در شهرستان های مشهد و گرمسار

خانواده انتروباکتریاسه باکتری های متعلق به خانواده آنتروباکتریاسه ، باسیل گرم منفی اند که تا 3 میکرون طول دارند این باکتری ها گلوکز و طیف وسیعی از قند ها را تخمیر کرده و اکسیداز منفی اند . آنها باکتری های کاتالاز مثبت و بی هوازی اختیاری غیر ها گدارایند که چون نمک ها صفراوی از رشد آنها جلوگیری نمی کند د رمک کانگی آگار بهخوبی رشد می نمایند . این اجرام روده ای نیترات رابه نیتریت احیا کرده و بعضی از گونه ها ، مانند ای کولای لاکتوز مثبت اند . تحرک این باکتری ها به وسیله تاژک هایی است که به صورت اطرافی روی باکتری استقرار یافته اند . این خانواده دارای بیش از 28 جنس و بالغ بر 80 گونه می باشد که کمتر از نیمی از این جنس ها در دام پزشکی حائز اهمیت اند . اصطلاح « کلیفرم» که سابقا تنها جهت توصیف آنتروباکتریاسه ها لاکتوز مثبت به کار می رفت اکنون برخی مواقع برای توصیف دیگر اعضای خانواده نیز مورد استفاده قرار می گیرد . آنتروباکتریاسه ها را می توان به طور قراردادی به سه گروه طبقه بندی نمود : پاتوژن ها ی اصلی ، پاتوژن های فرصت طلب و غیر پاتوژن ها . گروهی که برای حیوانات غیر بیماری زا محسوب می شوند همانند هافنیا و اروینیا را می توان از مدفوع ومحیط جدا کرد که ممکن است د رنمونه های مرضی نیز ایجاد آلودگی نمایند. پاتوژن های فرصت طلب ایجاد بیماری بالینی در اندام ها ومحل های خارج از دستگاه گوارش می کنند . پاتوژن های اصلی اشریشیاکلی ، گونه های سالمونلا و یرسینیا می تواند بیماری عمومی وروده ای ایجاد نمایند . شکل1-1اعضای مهم خانواده انتروباکتریاسه در دامپزشکی تمایز انتروباکتریاسه باسیلهای گرم منفی که اکسیداز منفی، بی هوازی اختیاری و قادر به رشد روس مک کانکی اگار باشند را می توان متعلق به خانواده انتروباکتریاسه دانست. جدای بعضی از سویه های اشرشیا کلی، باکتری رودهای کمی وجود دارد که روی اگار خوندار تولید همولیز کند. تخمیر لاکتوز روی آگارمکانکی: -پرگنه های لاکتوز مثبت و محیط اطرافی آنها به علت تولید اسید از لاکتوز ، صورتی رنگ می گردند . -پرگنه ها ی لاکتوز منفی و محیط اطرافی آنها به علت تولید قلیا از مصرف پپتن بی رنگ می گردند . * واکنش ها روی محیط های انتخابی / معرف : -از این محیط ها عموما می توان به سبز درخشان (bg) و گزیلوز – لیزین – دی اکسی کلات (xld) اشاره نمود که جهت تمایز سالمونلاها از دیگر پاتوژن های روده ای استفاده می شود . روی bg آگار ، پرگنه سالمونلاها و محیط اطرافی آنها و اکنش قرمز قلیائی نشان میدهند . روی محیط xld پرگنه های بسیاری از سروتیپ های سالمونلایی قرمز رنگ (واکنش قلیایی ) با مرکز سیاهند که علت آن تولید سولفوهیدروژن (h2c) است . - آگارائوزین – متیلن بلو (emb) جهت تشخیص اشریشیاکلی ها کاربرد دارد . پرگنه برخی از جدایه ها جلای فلازی دارد که منحصر به این باکتری است . مورفولوژی پرگنه ها - پرگنه ها موکوئیدی بیشتر مربوط به کلبسیلا و آنتروباکتر بوده و به ندرت در اشریشیا کلی نیز دیده می شود . گونه های پروتئوس روی محیط های غیر ممانعتی مانند آگار خون دار ، حرکت خزنده از خود بروز می دهند . -سراشیا مارسنس در میان پاتوژن های فرصت طلب به طور انحصاری تولید پیگمان قرمز می کند . واکنش در محیط سه قندی آهن دار (tsi) این محیط بدون هیچ ممانعت کننده ای جهت تایید پرگنه های سالمونلا های جدا شده روی bg و xld کاربرد دارد . دیگر پرگنه های جدا شده روی bg و xld نیز می توانند به وسیله واکنش های که در tsi ایجاد می کنند از هم متمایز گردند . tsi حاوی 1/0% گلوکز ، 1% لاکتوز و 1% ساکاروز و مواد شیمیایی جهت شناسایی تولید sh2 می باشد فنیل رد معرف تغییر ph است (قرمز در ph2/8 وزرد در ph4/6) تولید سولفید آهن سیاه رنگ ، شاخص تولید h25 در محیط می باشد . تلقیح باکتری از یک پرگنه تک در این محیط کشت ، نیاز به تلقیح نیزه ای در عمق و کشت خطی د رسطح شیب دار به وسیله آنس نوک تیز دارد . لوله ، با درپوش شل در 37 درجه سانتی گراد به مدت 18 ساعت انکوبه می شود . آزمایش های بیوشیمیایی -آزمایش تولید لیزین دکربوکسیلاز برای تمایز گونه های پروتئوس و سالمونلا که در محیط tsi واکنش های مشابه ای راایجاد می کنند به کار می رود . گونه های پروتئوس در این آزمایش منفی بوده در حالی که گونه های سالمونلا این آنزیم را تولید می کنند . تولید لیزین دکربوکسیلاز با رنگ ارغوانی محیط مایع مشخص می گردد در حالی که در آزمایش منفی ، رنگ محیط زرد است . -تولید آوره از بین گونه های پروتئوس و سالمونلا متمایز کننده است . پروتئوس آوره از مثبت و سالمونلا اوره از منفی است . - آزمایش imvic( تولید اندول ، آزمایش متیل رد ، آزمایش و گس- پروسکوئر و مصرف سیترات )گروهی از واکنشهای بیوشیمیایی اند که جهت متمایز اشریشیا کلی از دیگر لاکتوزهای مثبت به کار می روند . -آزمایش حرکت ، کلبسیلا ( غیر متحرک) متمایز می کند . هر دو گونه ، پرگنه های موکوئیدی مشابه ای ایجاد می کند که تمایز شان رامشکل می سازد. آزمایش های بیوشیمیایی تجاری تعدادی از آزمایش های بیوشیمیایی تجاری برای تمایز آنترو باکتریاسه از هم در دسترسند . بعضی از این سیستم ها ، طیف وسیعی از آزمایش های بیوشیمیایی را شامل می گردند ونتایج حاصل از آنها باالگوهای عددی کامپیوتری تطبیق داده می شود و جهت تمایز موارد جدا شده از هم در سطح گونه مورد استفاده قرار می گیرد. تعیین سروتیپ های اشریشیا کلی ، سالمونلا و یرسینا آزمایش آگلوتیناسیون روی لام ، به وسیله آنتی سرم ها جهت تعیین آنتی ژن های o (سوماتیک) و h تاژکی د رهر سه گروه به کار می روند که گاهی شامل آنتی سرم های k (کپسولی ) نیز می شوند . تعیین سروتیپ ها اجازه شناسایی اجرام دخیل در شیوع بیماری را داده و در مطالعات اپیدمولوژیک ، موارد استفاده بسیاری دارد . روش های مولکولی ، معمولا بر پایه آنالیز اسید نوکلئیک ، در آزمایشگاه های مرجع برای تمایز آنترو باکتریاسه ها از هم به کار می رود . اشرشیا کلی اشرشیاکلی معمولا با تاژک های اطراف متحرک و همچنین اغلب دارای فیمبریه است . این باکتری با تخمیر لاکتوز ایجادپرگنه های صورتی رنگ در سطح محیط مکانگی آگار کرده و ویژگی های بیوشیمیایی خاصی را در آزمایش های imvic تولید می نماید بعضی سویه ها زمانی که روی ائوزین متیلن بلو رشد می نمایند تولید جلای فلزی می کنند . فعالیت همولیتیک در محیط آگار خون دار از خصوصیات برخی از سویه های اشریشیا کلی است . پادگن های پیگیری (o) ، تاژکی (h) و گاهاکپسولی (k) برای تعیین سروتیپ های اشریشیا کلی کاربرد دارند . آنتی ژن های پیکری ماهیت پلی ساکاریدی داشته و در سطح جدار باکتری قرار دارند . ویژگی این آنتی ژن های پیکیری ماهیت پلی ساکاریدی داشته و در سطح جدار باکتری قرار دارند . ویژگی این انتی ژن ها به وسیله زنجیر جانبی کربوهیدراتی تعیین می گردد . آنتی ژن های تاژکی ماهیتی پروتئینی داشته و آنتی ژن ها به وسیله زنجیر جانبی کربوهیدراتی تعیین می گردد آنتی ژن های تاژکی ماهیتی پروتئینی داشته و آنتی ژن های کپسولی ، ترکیبی پلی ساکاریدی دارند . آنتی ژن های پروتئینی (f) به عنوان چسباننده ، اتصال به سطوح مخاطی را تسهیل می کنند . دستگاه گوارش پستان داران مدت کوتاهی پس از تولد ، از محیط اشریشیا کلی را اخذ می کند . این اجرام عنوان اعضای مهم فلور طبیعی روده در طول عمر حضور دارند . بسیاری از سویه های اشریشیا کلی حدت پاینی دارند اما می توانند به صورت فرصت طلب در خارج از دستگاه گوارش موجب بیماری هایی مانند بیماری های دستگاه اداری و غدد پستانی گردند . سویه های بیماری زای اشریشیا کلی عوامل بیماری زایی دارند که به آنها اجازه می دهد در سطوح مخاطی استقرار یافته و متعاقبا ایجاد بیماری نمایند . عوامل مستعد کننده ای که اجازه استقرار باکتری و حساس شدن حیوانات جهت بروز بیماری های بالینی است شامل سن ، وضعیت ایمنی ، ماهیت جیزه غذایی و نیز مواجهه با بارمیکروبی بالا از سویه های بیماری زا می باشد . تقسیم بندی های عمده سویه های بیماری زا اشریشیا کلی و اثرات بالینی آنها در شکل 4-11 آورده شده است . هیچ یک از سویه های بیماری زا به طور مطلق در یک گروه جای نمی گیرند . برخی از سویه ها ممکن است اثرات بالینی مشخص ترین نسبت بهسایر سویه ها از خودشان دهند . در سالهای اخیر ، اشریشیا کلی سویه h7 :o157 به عنوان پاتوژن عمده مشترک میان انسان و دام که قابل انتقال از طریق غذا می باشد مسئول سندرم اورمیک همولیتیک – کولیت خونریزی دهنده شناخته شده است . پاتوژنز و پاتوژنیسیته عوامل حدت سویه های پاتوژن اشریشیا کلی ، کپسول ، آندوتوکسین ، ساختارهای مسئول کلونیزه شدن باکتری ، آنتروتوکسین و دیگر مواد ترشحی است . کپسول پلی ساکاریدی ، که به وسیله برخی سویه های اشریشیا کلی تولید می گردد ، با مقاومت در برابر فاگوستوز جرم ارتباط دارد . ماده کپسولی که اندکی آنتی ژنیک نیز است اثرات ضد باکتریایی دستگاه کمپلمان را مختل می نماید . اندوتوکسین ، ترکیب لیپوپلی ساکاریدی (lps) دیواره سلولی باکتری های گرم منفی است ، که در اثر مرگ باکتری ها آزاد می گردد . این ترکیب شامل بخش لیپید a ، هسته پلی ساکاریدی و زنجیره جانبی اختصاصی است .نقش lps در بیماری شامل تب زائی ، آیب آندولیالی و به دنبال آن انعقاد داخل عروقی منتشر وشوک آندو توکسیک است این اهمیت زیادی در بروز بیماری سپتی سمیک دارند . پروتئین های اتصالی فیمبریه ای روی بسیاری از سویه های انتروتوکسین زای اشریشیا کلی وجودداشته و با عث چسبیدن آ»ها به سطوح مخاطی روده کوچک و دستگاه ادراری تحتانی را می شود . چسبیدن محکم به مخاط همراه با کاهش اثرات حرکت پریستالتیک روده و جریان ادرار موجب تسهیل در استقرار باکتری می گردد . مهمترین پروتئین های اتصالی فیمبریه ای در سویه های اشریشیاکلی ایجاد کننده بیماری در حیوانات اهلی شامل k88(f4) ، k99(f5) ، 978p(f6) ، f41 می باشد . قبلا از این ، از روی سهو برخی از این پروتئین ها ، آنتی ژن کپسولی (k) تصور شده و برخی دیگر از آنها بر اساس اینکه فیمبریه ، قبلا پیلی نامیده می شد با حرف p مشخص گریده اند (987p) . بسیاری از پروتئین های چسباننده ای که در خوک یافت می شدند . k88 می شوند .k99 و f41 در گوساله ها و k99 در بره ها دیده می شود . تعداد گیرنده های k88 در روی آنتروسیت ها ی خوک ، به طور ژنتیکی معین شده و با افزایش سن از میزان آنها کاسته می گردد. اگر چه توله خوک های نوزاد نسبت به سویه های اشریشیا کلی دارای پروتئین 987p حساس می باشند ، ولی مقاومت در برابر کلو نیزه شدن در سن سه هفتگی تکوین می یابد . هر دو پادگن k88وk99 به وسیله پلاسمیدها رمز می شوند . پروتئین چسباننده دیگری که به اصطلاح اینتیمین نامیده می شود، ظاهرا برای اتصال اشریشیاکلی های آنتروپاتوژن (epec) به انتروسیت ها ضروریست . اثرات پاتولیژیک عفونت های حاصل از اشریشیاکلی های بیماری زا ، به غیر از مواردی که مربوط به آندوتوکسین هاست ،عمدتا مربوط به تولید انتروتوکسین ها ، وروتوکسین ها و یا عوامل نکروز کننده سمیت یاخته ای می باشد . برعکس انتروتوکسین ها کهتنها روی فعالیت عملکردی انتروسیت ها موثرند ، ورودتوکسین ها و عوامل نکروز کننده سمیت یاخته ای آسیب های سلولی قابل مشاهده در محل عمل خویش ایجاد می کنند . دو نوع از انتروتکسین ، مقاوم در برابر حرارت (st) و حساس در برابر حرارت (lt) شناسایی شده است که در هر یک از آنها به دو زیر گروه تقسیم می شوند . بسیاری از سویه های روده را از طریق تحریک فعالیت آدنیلات سیکلاز افزایش می دهد . بسیاری از سویه های تولید کنند lt1 ، همچنین دارای آذرین k88 هستند . دومین توکسین حساس به حرارت ، lt2 می باشد که در برخی از سویه های etec جدا شده از گاو ،نشان داده شده است . یکی از زیر گروه های انتروتوکسین مقاوم در برابر حرارت ، sta است که در سویه های etec جدا شده از خوک ، گاو ، گوسفند و انسان ، شناسایی شده است . این سم ، فعالیت گوانیلات سیکلاز را در انتروسیت ها افزایش داده و در نهایت باعث افزایش گوانوزین منوفسفات داخل سلولی می گردد که ترشح مایعات و الکترولیت ها را به درون روده کوچک تحریک کرده و مانع جذب مایعات از روده می شود . اثرات دقیق سیتوتوکسیک دیگر آنتروتوکسین مقاوم در برابر حرارت ، یعنی stb هنوز به طور کامل شناخته نشده است . وروتوکسین ها (vt) از نظر ساختاری ، عمل کردی و آنتی ژنی شبیه به سم شیگا ، شیگلا دیسانتری هستند . این توکسین ها حساس به حرارت بوده و برای سلول های کشت سلولی ورو خاصیت کشندگی دارند . اشریشیا کلی های تولدی کننده و رتوکسین (vetc) به انتروسیت ها آسیب رسانده و زمانی که جذب خون می شوند ، اثرات زیان برا خود را روی سلول های آندوتلیالی در مناطق اناتومیک میعنی مانند سیستم اعصاب مرکزی خوک اعمال می نمایند . وروتوکسین ها نه تنها از سنتز پروتئین در یوکاریوت ها جلوگیری می کنند بلکه اثرات نسبتا شدید را در بافت های خاص ایجاد می نمایند که ممکن است این اثرات مروبطه به اختلاف در گیرنده های این توکسین در بافت های مذکور باشد . آسیب عروقی می تواند منجر به ادم ،خونریزی و ترمبوز گردد . وروتوکسین vt2e موحجب بیماری ادم و خوک می گردد . دو نوع از عوامل نکروز کننده سیتوتوکسیک شامل cnf1 و cnf2 در عصاره سویه های اشریشیاکلی های جدا شده از موارد اسهال ، سپتی سمی و عفونت های دستگاه ادراری حیوانات و انسان دیده شده است . cnf1 به صروت کروموزمی رمز شده اما cnf2 به وسیله پلاسمیدی قابل انتقالی به نام vir رمز می شود . اگر چه مشخص شده است ، اکه اینتوکسین ها تغییرات پاتولوژیک در حیوانات آزمایشگاهی و کشت بافت ایجاد می کنند ، اما نقش اشریشیاکلی های تولید کنند هcnf د ربیماری هایی که به طور طبیعی رخ می دهد ، هنوز نامشخص است . آلفا همولیزین ، اگر چه اغلب شاخص مفیدی برای بیماری زایی در سویه های خاص اشریشیا کلی است ، اما ظاهرا به طور مستقیم در بیماری زایی مشارکت نداشته و فقط با بروز دیگر عوامل بیماری زادر ارتباط است . تولید همولیزین اغلب از خصوصیات سویه هایی از اشریشیا کلی است که خوک های مبتلا به بیماری آدم و اسهال جدا شده اند . این امر بیانگر این است که عمل آلفا همولیزین میزان دسترسی اجرام مهاجم به آهن را بالا می برد . سیدرو فورها ، مولکولهای متصل به آهن مانند آئروباکتین و آنتروباکتین به وسیله برخی از سویه های بیماری زا اشریشیاکلی ، سنتز می گردند . زمانی که میزان آهن در دسترس فاتی پایین باشد ، این مولکولها با اتصال به آهن موجبات ادامه حیات باکتری را فراهم می نمایند . سویه های بیماری زا اشریشیا کلی که فاقعد عامل بیماری زایی تعریف شده اند عبارتند از: پیش از این اصطلاح اشریشیاکلی های آنتروپاتوژنیک (epec) دراشاره به همه سویه های بیماری زامورد استفاده قرار می گرفت . اخیرا این اصطلاح ، معادل سویه های اشریشیا کلی های aeec به کار می رود . اگر چه وروتوکسین ها به وسیله بسیاری از سویه های اشریشیاکلی اتصالی و محو کننده (aeec) تولید می گردد ، اما از توکسین به ظاهر مستقیما در ایجاد ضایعات روده ای دخالت ندارند (hall و همکاران 1988) بعد از اتصال به آنتروسیت ها ، سویه های aeec موجب محو میکروویلی ها ، ریزش آنتروسیت های نابالغ و بدشکلی ویلی ها می گردند . تخریب اپی تلیال روده ، اسهال خونی را بدنبال دارد (wrayو همکاران 1989). اصطلاح اشریشیاکلی های آنتروهتموراژیک برای سویه هایی مانند o157:h7 که موجب اسهال خونی در انسان می گردند ، به کار می رود.